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HRM分析試劑盒 (EvaGreen)(FP210)

廠家:天根生化科技(北京)有限公司
  目錄號 規 格 價 格
FP210-02 20μl×500次 2480元
FP210-01 20μl×125次 720元

產品簡介

本產品結合了飽和染料EvaGreen 和抗體酶的優點,是一款適用于高分辨率熔解曲線(High Resolution Melting,HRM)分析的專業試劑盒。本品是一種2× PreMix,PCR 反應液配制十分簡單方便;具有分辨率高和模板高度適應性等特點。與SYBR Green 不同,EvaGreen 在高濃度情況下不會抑制PCR 反應;可以使雙鏈PCR 產物的結合量達到飽和狀態,所以稱為“飽和染料”。不會產生SYBR Green 的“染料重排”現象,能夠很好的區分擴增產物之間單個堿基的差異。本產品可用于已知SNP 分析,未知SNP 篩選,以及未知突變基因掃描和甲基化PCR 分析等研究。

產品特點

■ 高分辨率:采用EvaGreen 飽和染料,在飽和狀態下具很高的熔解曲線分辨率,可以區分單個堿基的變異。

■ 高特異性:采用抗體修飾的熱啟動DNA 聚合酶,降低非特異性擴增,提高特異性。

■ 高穩定性:精心優化Buffer 體系,增加了熔解曲線的穩定性,提高結果可信度。

■ ROX 校正:單獨包裝的ROX 染料,使用更靈活,結果更準確。

儲存條件

收到本產品后, 請立即置于-20 避光保存。從-20 取出使用時, 將凍存的2x HRM Analysis PreMix50×ROX Reference Dye溶解,然后輕輕顛倒混勻,待溶液完全均一后再行使用。如解凍后沒有使用,須徹底混勻后重新冷凍(在解凍過程中鹽會出現分層現象,未混勻進行冷凍,鹽晶體的析出將會對酶造成損害)。如需一段時間內經常取用,可在28條件下儲存3個月。避免反復多次凍融。

 

注意事項

1.本產品中含有熒光染料EvaGreen,保存本產品或配制PCR反應液時應避免強光照射。

2.如果試劑沒有混勻,其反應性能會有所下降。使用時請上下顛倒輕輕混勻,請不要使用振蕩器進行混勻,盡量避免出現泡沫,并經瞬時離心后使用。

3.引物純度對反應特異性影響很大,建議使用PAGE級別以上純化的引物。

420 μl反應體系中,基因組DNA模板的使用量一般小于100 ng,并盡量保持不同反應之間有相同的模 量。模板純度,OD260/280 1.6~2.0,OD260/230 1.5~2.0。

5.由于HRM具有很高的靈敏性,因此在條件允許的情況下推薦使用50 ul反應體系,大的反應體系可以提高反應重復性,減少實驗誤差對熔解曲線的負面影響。

6.引物設計:較短的PCR產物可以提高HRM的分辨率;因此在設計PCR引物時,遵循普遍的原則外,盡量保持產物長度在80~120之間。SNP位點盡量處在PCR產物序列中間位置。


實驗例

使用DP318 提取100 μl 人類血液樣本,上樣量50 ng,根據NCBI SNP 數據庫,選取FEN1 基因的已知SNP (rs174538) 使用Roche LightCycle480 檢測,結果如下:



實驗結果顯示,HRM Analysis Kit 的相同基因型熔解曲線重復性高,不同基因型分辨明確,不存在誤判,是理想的

SNP 位點分析方法。

SNP 信息:......CGGAAGAACACGTCG[A/G]CAGGAGCAGGCGCCT...... (Allele Frequency:A=0.314,G=0.686)

引物:擴增108 bp 的片段(所用引物FEN1_F:CCTCAACGCTCTCACCATTTTG;FEN1_R:GGCACTTCCTTTTCCGGTTGTG)


實驗例

根據NCBI SNP 數據庫,選取已知的SNP 進行檢測,檢測的SNP 信息如下:

RefSNP number:rs174538Gene Name:FEN1 (flap structure-specific endonuclease 1)序 列:CGCTCCGCCACCGGAAGAACACGTCG[A/G]CAGGAGCAGGCGCCTAGCACAACCGAllele Frequency:A=0.314,G=0.686根據該SNP 位點兩側序列信息,設計引物:FEN1_F:CCTCAACGCTCTCACCATTTTG;FEN1_R:GGCACTTCCTTTTCCGGTTGTG;擴增PCR 產物長度為108 bp。配置反應體系,在Roche LightCycle480 儀器上運行,檢測24 個個體,結果如下:


圖1. 對已知SNP 進行檢測,NCBI Assay ID 為ss869699;PCR 產物長度為108 bp;24 個檢測樣本。Roche LightCycler480 儀器運行, 收集熔解曲線信號參數:Ramp Rate 0.05;Acquisitions 12; Gene scanning 方法分析。結果中可以看出,HRM Analysis Kit 的不同基因型分辨明確,相同基因型熔解曲線重復性高,不存在誤判。

儀器要求

HRM 對儀器的要求較高,ABI 7500 Fast ,ABI 7900HT,Roche LightCycler 480,Qiagen Roter-Gene 等配合專用軟件可進行HRM 實驗。

地址:北京市海淀區西小口路66號東升科技園(北領地)C7-3 電話:800-990-6057
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